摘要

神經(jīng)元鈣傳感器-1（NCS1）屬于神經(jīng)元鈣傳感器（NCS）蛋白家族。NCS1由四個(gè)EF-手基序和一個(gè)N-末端肉豆蔻酰化組成。然而，鈣-肉豆蔻酰開關(guān)在NCS1中的存在及其在膜結(jié)合中的作用存在爭議。因此，Langmuir脂質(zhì)單層模型用于模擬細(xì)胞膜，以表征NCS1的膜相互作用。從單層測量中計(jì)算出兩個(gè)結(jié)合參數(shù)：最大插入壓力，在該壓力下蛋白質(zhì)結(jié)合是能量有利的，以及協(xié)同作用，報(bào)告與脂質(zhì)單層的吸引或排斥相互作用。在肉豆蔻酰化NCS1存在下進(jìn)行的結(jié)合膜測量顯示，由磷酸乙醇胺極性頭基和不飽和脂肪酰基鏈組成的磷脂具有更好的結(jié)合相互作用。在沒有鈣的情況下，膜結(jié)合測量值被徹底修改，表明蛋白質(zhì)與膜的結(jié)合更牢固。事實(shí)上，NCS1的三個(gè)EFhand基序與鈣的結(jié)合導(dǎo)致構(gòu)象變化。因此，膜上的NCS1排列可以重新排列，以更好地與其基質(zhì)相互作用。NCS1的N末端肽由兩個(gè)參與NCS1膜相互作用的兩親螺旋組成。此外，肉豆蔻酰基的存在對NCS1的膜結(jié)合有微弱的影響，表明該蛋白質(zhì)中缺乏鈣-肉豆蔻酰基開關(guān)機(jī)制。因此，肉豆蔻酰化可能在NCS1的折疊/去折疊中發(fā)揮所需的結(jié)構(gòu)作用，這對其多種生物學(xué)功能至關(guān)重要。

1、引言

鈣信號在細(xì)胞功能中起著至關(guān)重要的作用[1-3]。事實(shí)上，鈣是一種細(xì)胞內(nèi)信使，參與多種生物過程，如神經(jīng)元可塑性和神經(jīng)傳遞[4-7]。細(xì)胞對鈣反應(yīng)的多樣性由一個(gè)EF-hand鈣結(jié)合蛋白家族提供，包括神經(jīng)元鈣傳感器（NCS）蛋白亞家族[8-10]。NCS家族有14個(gè)成員，由四個(gè)EF-手基序（兩個(gè)由短環(huán)區(qū)連接的螺旋）和一個(gè)N-末端肉豆蔻酰化共識序列組成。

在NCS家族的蛋白質(zhì)中，神經(jīng)鈣傳感器-1（NCS1）在大多數(shù)神經(jīng)元類型以及發(fā)育中的心肌細(xì)胞和肥大細(xì)胞中表達(dá)[11-13]。NCS1主要定位于細(xì)胞膜，參與多種功能，如促進(jìn)神經(jīng)遞質(zhì)釋放[14-17]，調(diào)節(jié)磷脂酰肌醇4-激酶[18-21]的脂質(zhì)激酶活性和調(diào)節(jié)鉀通道[22]。NCS1是一種22 kDa肉豆蔻酰化蛋白，具有四個(gè)EF-手基序，其中EF1是隱蔽的，因此不與鈣結(jié)合。之前已經(jīng)確定了鈣存在下非肉豆蔻酰化NCS1的三維結(jié)構(gòu)（圖S1）[23]。EF-hands 1-3的鈣結(jié)合誘導(dǎo)蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化，導(dǎo)致C-末端片段的擠出和大的疏水裂縫的暴露[23,24]。這種構(gòu)象變化允許蛋白質(zhì)通過其疏水裂縫結(jié)合多種底物[25-29]。

鈣-肉豆蔻基開關(guān)是一種分子調(diào)節(jié)機(jī)制，導(dǎo)致肉豆蔻基在鈣存在的情況下從疏水裂縫中擠出[30-35]。鈣-肉豆蔻酰開關(guān)的存在已被證明存在于幾種NCS蛋白質(zhì)中，如recoverin、VILIP-1、VILIP-3和hippocalcin。然而，存在鈣的非肉豆蔻酰化NCS1的三維結(jié)構(gòu)不允許確認(rèn)這種機(jī)制的存在[23]。此外，在NCS1中存在鈣-肉豆蔻酰開關(guān)是有爭議的。核磁共振（NMR）、熒光和平衡鈣結(jié)合測量表明，芽殖酵母的NCS1同系物（Frq1）可能具有鈣-肉豆蔻酰開關(guān)[36]。這一建議得到了裂變酵母（NCS1）NCS1同系物核磁共振結(jié)構(gòu)測定的支持[28]。事實(shí)上，Ncs1十四烷基在沒有鈣的情況下被埋入空腔中，在有鈣的情況下被擠出。然而，NCS1、NCS1和Frq1的序列不相似，可能導(dǎo)致結(jié)構(gòu)差異（圖1）。事實(shí)上，分裂酵母Ncs1和芽殖酵母Frq1與哺乳動物Ncs1的同源性分別為69.5%和60.0%。此外，結(jié)構(gòu)分析允許識別NCS1 N-末端段內(nèi)6個(gè)殘基的基序，即使在沒有鈣的情況下，這些基序也將肉豆蔻酰基鎖定在暴露的構(gòu)象中[29]。這6個(gè)殘基基基序（圖1中以紅色突出顯示）對于每個(gè)物種都非常不同。這種差異可以解釋Frq1和Ncs1存在鈣-肉豆蔻酰開關(guān)，這與它們的人類同源物Ncs1不同。NCS1功能的模型強(qiáng)調(diào)了與鈣的存在無關(guān)的本構(gòu)膜結(jié)合[37]。此外，鈣在體外和神經(jīng)細(xì)胞系中的膜結(jié)合不需要鈣，這表明缺乏鈣-肉豆蔻酰開關(guān)[37,38]。其他出版物使用這些不同的結(jié)果來證實(shí)或否認(rèn)NCS1中存在鈣-肉豆蔻酰開關(guān)[10,27,39-41]。盡管對NCS1進(jìn)行了大量研究，但鈣-肉豆蔻酰開關(guān)的存在仍有疑問，其確切機(jī)制尚待確定。

圖1.人類NCS1（橙色）、裂變酵母NCS1（粉紅色）和芽殖酵母Frq1（藍(lán)色）的序列比對。在鈣存在和不存在的情況下，負(fù)責(zé)肉豆蔻基擠出的基序用紅色表示[29]（為了解釋本圖例中對顏色的引用，讀者請參閱本文的網(wǎng)絡(luò)版本）。

本出版物旨在研究在鈣及其肉豆蔻酰基存在和不存在的情況下NCS1的膜結(jié)合，以解決當(dāng)前的爭議。此外，關(guān)于NCS1膜結(jié)合的信息很少。核磁共振分配表明，在膜存在和不存在的情況下，NCS1發(fā)生結(jié)構(gòu)變化[42]。此外，對兩種不同的脂質(zhì)囊泡（棕櫚酰油酰基磷酸絲氨酸POPS和棕櫚酰油酰基磷酸膽堿POPS）進(jìn)行了熒光測量，表明NCS1以鈣依賴性方式結(jié)合POPS囊泡[24]。最后，免疫細(xì)胞化學(xué)數(shù)據(jù)顯示，在Triton X-100提取后獲得的耐去污膜（DRM）中發(fā)現(xiàn)少量NCS1[43]。然而，磷脂的組成對NCS1的膜結(jié)合的影響尚未描述。在本出版物中，Langmuir脂質(zhì)單層模型用于模擬細(xì)胞膜，并確定幾種條件下NCS1的膜結(jié)合參數(shù)。

首先，研究了肉豆蔻酰化NCS1（mNCS1）在具有不同磷脂單分子膜的鈣存在下的膜結(jié)合行為。這些數(shù)據(jù)可以表征磷脂成分對蛋白質(zhì)結(jié)合的影響。然后在沒有鈣的情況下進(jìn)行相同的實(shí)驗(yàn)，以了解構(gòu)象變化對其結(jié)合的影響。然后研究了非肉豆蔻酰化NCS1（nmNCS1）的行為，以突出肉豆蔻酰基團(tuán)在存在或不存在鈣的情況下的作用。最后，使用一種類似于NCS1 N末端片段的肽來更好地了解其在蛋白質(zhì)膜結(jié)合中的作用。

2、材料和方法

2.1.布料

用于制備緩沖溶液的去離子水來自Barnstead Nanopure系統(tǒng)（Barnstead，Dubuque，IA）。其電阻率和表面張力在20?C分別為18.2 M×cm和72 mN/M。磷脂來自Avanti極性脂質(zhì)（Alabaster，Al）：二棕櫚酰膽堿（DPPC）、二硬脂酰膽堿（DSPC）、二油酰膽堿（DOPC）、二氧羰基六烯醇磷酸膽堿（DDPC）、二棕櫚酰磷酸乙醇胺（DPPE）、二硬脂酰磷酸乙醇胺（DSPE）、二油酰磷酸乙醇胺（DOPE），雙二十二碳六烯基磷酸乙醇胺（DDPE）、二棕櫚酰磷酸絲氨酸（DPPS）、二硬脂酰磷酸絲氨酸（DSPS）、二油酰磷酸絲氨酸（DOPS）和雙二十二碳六烯基磷酸絲氨酸（DDPS）。CaCl2、Hepes和巰基乙醇來自西格瑪（密蘇里州圣路易斯）。KCl和EGTA來自實(shí)驗(yàn)室Mat（魁北克，QC）。由DO和DD酰基鏈組成的溶液在氯仿中以0.1 mg/mL的濃度制備，并在氬氣下儲存，在5.5 mg/mL的抗氧化劑BHT存在下?20?C、所有其他化學(xué)品均按收到時(shí)使用。

2.2.NCS1的表達(dá)和純化

mNCS1和nmNCS1如前所述過表達(dá)和純化[44,45]。使用標(biāo)準(zhǔn)9-芴甲氧基羰基/二丙基碳二亞胺（Fmoc/DIC）化學(xué)[46]通過固相程序合成N-末端肽。在合成的最后一步，使用肉豆蔻酸酐和標(biāo)準(zhǔn)偶聯(lián)程序[46]對N-末端甘氨酸進(jìn)行肉豆蔻酰化。

2.3.結(jié)合參數(shù)的測量

使用DeltaPi4微張力計(jì)和Kibron Inc.（芬蘭赫爾辛基）的500L玻璃槽（2 cm2），通過Wilhelmy方法測量表面壓力（）。在每次實(shí)驗(yàn)之前，用自來水沖洗玻璃槽，然后在乙醇存在下用Q-Tip刷洗。在用去離子水進(jìn)行大量沖洗之前，這些清洗重復(fù)3次。然后通過表面抽吸干燥槽。實(shí)驗(yàn)裝置放置在21±1的有機(jī)玻璃箱內(nèi)?C帶濕度控制。亞相緩沖液包含50 mM Hepes、3 mM巰基乙醇、50 mM KCl和pH 7.2下的1 mM CaCl2或5 mM EGTA。

將幾微升溶解在氯仿（1 mg mL）中的磷脂分散成磷脂單層?1）直到達(dá)到所需的初始表面壓力（i）。攤鋪溶劑蒸發(fā)和薄膜達(dá)到平衡的等待時(shí)間隨脂質(zhì)類型、攤鋪體積、初始表面壓力和脂質(zhì)濃度而變化[47]。然后將NCS1注入該單層下方，以達(dá)到274nm的最佳最終濃度。監(jiān)測蛋白質(zhì)與磷脂單層結(jié)合的動力學(xué)，直到在不攪拌的情況下（通常為3小時(shí)）達(dá)到平衡表面壓力（e）。注入NCS1后測得的表面壓力增加（）對應(yīng)于e–i。

結(jié)合參數(shù)的計(jì)算如前所述[47,48]。簡而言之，在脂質(zhì)單層的不同i值下進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)合測量。然后，作為i函數(shù)的圖允許通過將圖的回歸外推到x軸來確定最大插入壓力（MIP）。MIP的不確定性是根據(jù)前面描述的線性回歸實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的協(xié)方差計(jì)算的[48]。事實(shí)上，這種不確定性已確定如下：回歸y=ax+b可以從的圖中獲得，作為i的函數(shù)。MIP在y=0時(shí)計(jì)算。因此，x=?b/a或i=?b/a.因此，置信區(qū)間（CI）由以下公式得出：95%CI=i±1.96 Var（i），其中1.96的值來自95%置信區(qū)間的標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)（z）分布表中的z值。Var（i）由delta方法確定，使用，

其中，Var（a）和Var（b）由標(biāo)準(zhǔn)誤差（SE）的平方獲得，例如Var（a）=SE（a）2。使用SPSS軟件計(jì)算a和b的SE。Cov（a，b）通過使用，

其中′x是i的平均值，而是使用SPSS軟件獲得的剩余平均值。協(xié)同值對應(yīng)于圖e的線性回歸斜率，作為圖i的函數(shù)[47]。也可以通過將的線性回歸斜率加1作為i的函數(shù)來獲得[49]。使用（（e）（1）計(jì)算協(xié)同效應(yīng)的不確定性?r2）1/2）/（（i）（n）?2）1/2），其中是標(biāo)準(zhǔn)差，r是相關(guān)系數(shù)，n是點(diǎn)數(shù)。我們最近創(chuàng)建了一個(gè)免費(fèi)的網(wǎng)頁，在那里可以很容易地計(jì)算這些綁定參數(shù)和實(shí)驗(yàn)誤差(/http://www.crchudequebec.ulaval.ca/BindingParametersCalculator/）。

使用以下適用于Pitcher等人[50]測量的表面壓力的拉伸指數(shù)方程擬合蛋白質(zhì)或肽在磷脂單分子膜上吸附期間記錄的表面壓力與時(shí)間的值：?ie?（kt）ˉ，其中t是時(shí)間t時(shí)單層的表面壓力，k是速率系數(shù)，t是時(shí)間，ˉ是固定為0.001的指數(shù)比例因子。

結(jié)果和討論

3.1.mNCS1的膜結(jié)合

細(xì)胞膜是復(fù)雜的脂質(zhì)雙層，在一些生物過程中起著至關(guān)重要的作用。此外，大約25%的整個(gè)蛋白質(zhì)組與這些膜動態(tài)相互作用，并參與其不同的功能[51,52]。Langmuir脂質(zhì)單層是一種巧妙的模型膜系統(tǒng)，用于研究空氣/水界面的蛋白質(zhì)-脂質(zhì)相互作用[48,53-56]。此外，雙層和單層之間存在直接熱力學(xué)關(guān)系[57,58]。該模型可以通過控制不同參數(shù)（如表面壓力）來表征蛋白質(zhì)吸附和脂質(zhì)特異性。如第2.3節(jié)所述，最大插入壓力（MIP）和協(xié)同作用是兩個(gè)結(jié)合參數(shù)，可以通過單層測量計(jì)算。MIP值是蛋白質(zhì)結(jié)合能量有利的最大表面壓力。負(fù)協(xié)同值表示蛋白質(zhì)與磷脂單層的不利結(jié)合，而正協(xié)同值表示有利結(jié)合[47]。事實(shí)上，該參數(shù)與蛋白質(zhì)和脂質(zhì)單層之間的協(xié)同作用有關(guān)。在有鈣和無鈣的情況下，計(jì)算了mNCS1的這兩個(gè)參數(shù)，以表征mNCS1的膜結(jié)合以及該離子對其結(jié)合的影響。

3.1.1.鈣存在下mNCS1的膜結(jié)合

為了在每次實(shí)驗(yàn)中獲得最佳且可重復(fù)的表面壓力變化，蛋白質(zhì)的量必須使脂質(zhì)單層飽和。因此，在朗繆爾槽中注入了幾種濃度的NCS1。平衡時(shí)的表面壓力值在274 nM的濃度下達(dá)到平臺（圖S2）。該飽和濃度用于所有后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

NCS1主要表達(dá)于神經(jīng)元、肥大細(xì)胞和心肌細(xì)胞[11-13]。神經(jīng)元膜由51 mol%的磷酸膽堿（PC）、29 mol%的磷酸乙醇胺（PE）和5 mol%的磷酸絲氨酸（PS）組成[59]。類似地，肥大細(xì)胞膜由50 mol%PC、25 mol%PE和15 mol%PS組成[60]。此外，心肌細(xì)胞膜由23 mol%PC、41 mol%PE和8 mol%PS組成[61]。PE是一個(gè)較小的兩性離子極性頭基團(tuán)，而PC是一個(gè)較大的（圖S3）。PS也比PE大，帶負(fù)電。這三個(gè)最具代表性的極性頭基團(tuán)已用于存在不同脂肪酰基鏈的情況下，以評估脂質(zhì)成分對NCS1膜結(jié)合的影響。事實(shí)上，已經(jīng)選擇了四個(gè)脂肪酰基鏈（二棕櫚酰DP、二硬脂酰DS、二油酰基DO和二羰基六烯基DD）（圖S3）。細(xì)胞膜主要由這四條脂肪酰基鏈組成，這四條脂肪酰基鏈通常占總脂肪酰基鏈的60%以上。例如，心肌細(xì)胞膜由14 mol%DS、27 mol%DP、16 mol%DO和5 mol%DD組成，帶有PE極性頭群[61]。DP和DS分別是由16個(gè)和18個(gè)碳組成的飽和脂肪酰基鏈。DO和DD分別是由18個(gè)和22個(gè)碳組成的不飽和脂肪酰基鏈。DO只有一個(gè)不飽和（雙鍵），而DD有6個(gè)不飽和。這些組成差異會導(dǎo)致幾種物理狀態(tài)（液體膨脹、液體冷凝或固體冷凝），這些物理狀態(tài)會影響蛋白質(zhì)的膜結(jié)合[49]。此外，細(xì)胞膜的脂質(zhì)在大多數(shù)細(xì)胞器（包括質(zhì)膜）的膜中不對稱分布（見參考文獻(xiàn)[62]）。因此，Langmuir脂質(zhì)單層模型允許獨(dú)立測定蛋白質(zhì)與外膜或內(nèi)膜小葉中脂質(zhì)的結(jié)合。因此，在鈣存在的12種不同磷脂單分子膜下注射了mNCS1。

確定綁定參數(shù)的典型示例如圖2所示。實(shí)際上，對于6.0、8.0、16.2和24.2 mN/m的i，分別獲得了21.0、19.0、12.9和8.0 mN/m的（圖2插圖）。被繪制為i的函數(shù)，導(dǎo)致負(fù)斜率。因此，在DPPE存在的情況下，mNCS1的MIP值為35.8±1.1 mN/m，協(xié)同值為0.30±0.02。這種積極的協(xié)同作用表明mNCS1和這種脂質(zhì)單層之間發(fā)生了積極的相互作用。然后，以不同的i注射每種脂質(zhì)和MIP，并根據(jù)表面壓力動力學(xué)計(jì)算協(xié)同值。

圖2.在鈣存在下測定mNCS1與DPPE單層結(jié)合參數(shù)的典型示例。最大插入壓力（MIP）通過外推圖作為初始表面壓力（i）的函數(shù)來確定，其中曲線在x軸上達(dá)到0值。通過在該圖的斜率上添加一個(gè)來計(jì)算協(xié)同效應(yīng)。插圖：mNCS1在6.0、8.0、16.2和24.2 mN/m的不同i下與DPPE單層的典型結(jié)合動力學(xué)，作為達(dá)到平衡（e）的時(shí)間函數(shù)（為清楚起見，僅顯示了一些動力學(xué)）。從表面壓力的增加（–i）中減去初始表面壓力，并繪制為時(shí)間的函數(shù)。

圖3比較了含12種不同磷脂的mNCS1的MIP值和協(xié)同值（數(shù)值見表S1）。膜側(cè)壓力的估計(jì)范圍為30–35 mN/m[63–70]。因此，可以假設(shè)低于下限的MIP（30 mN/m）表明蛋白質(zhì)不會穿透細(xì)胞膜。然而，MIP大于下限將表明蛋白質(zhì)將能夠廣泛滲透到生物膜中。用PS和PC脂質(zhì)單層觀察到的所有MIP值均低于估計(jì)的膜側(cè)壓力下限(～30 mN/m），DOP除外。然而，在PE脂質(zhì)單層中觀察到的MIP值大于或等于30 mN/m。這些數(shù)據(jù)表明，mNCS1可能與由PE組成的膜結(jié)構(gòu)域在生理上相互作用，與由PC和PS組成的結(jié)構(gòu)域不同。在mNCS1中觀察到的協(xié)同值證實(shí)了這一趨勢。事實(shí)上，PE脂質(zhì)單分子膜的協(xié)同值大于PS和PC脂質(zhì)單分子膜的協(xié)同值，DO脂肪酰基鏈除外。此外，與四種PE脂質(zhì)單分子膜觀察到的協(xié)同值相當(dāng)高。這些數(shù)據(jù)證實(shí)了mNCS1對PE脂質(zhì)單分子膜更好的結(jié)合作用。這種趨勢可以用PE特性來解釋，PE特性是一種廣泛存在于神經(jīng)元膜中的兩性離子極性頭群[59]。事實(shí)上，其弱位阻可以允許mNCS1插入脂肪酰基鏈，而不管脂肪酰基鏈如何。

圖3.在鈣存在下，使用DPP、DSP、DOPS、DDPS、DPPC、DSPC、DOPC、DDC、DDPC、DPPE、DSPE、DOPE、DOPE和DDPE單層的mNCS1的MIP（A）和協(xié)同（B）值。MIP和synergy值的不確定性如第2.3節(jié)所述計(jì)算。

在DPP和DPPC單分子膜的存在下觀察到負(fù)協(xié)同值，表明NCS1與這些脂質(zhì)的結(jié)合不利。此外，提及排除壓力比提及aMIP更合適。實(shí)際上，協(xié)同作用小于0時(shí)獲得的MIP可以稱為“排斥壓力”，因?yàn)樗鼘?yīng)于蛋白質(zhì)和單層之間的排斥。在DPP存在下觀察到的強(qiáng)排斥（協(xié)同作用?0.12±0.07）可以用mNCS1的電荷分布來解釋（圖4）。事實(shí)上，將與單分子膜相互作用的片段可能帶負(fù)電，因此由于PS極性頭基團(tuán)的負(fù)電荷而被靜電斥力延遲。然后，分布在整個(gè)蛋白質(zhì)中的多個(gè)負(fù)電荷可能在蛋白質(zhì)與膜的結(jié)合和定向中發(fā)揮作用。相反，PC極性頭基是兩性離子，但具有很強(qiáng)的空間位阻。這種構(gòu)象可以解釋MIP的低值，在這種極性頭部基團(tuán)中低于30 mN/m，因此mNCS1結(jié)合PC脂質(zhì)單分子膜的能力降低。

圖4.nmNCS1結(jié)構(gòu)上的正（紅色）和負(fù)（藍(lán)色）電荷（PDB 2LCP）[23]（關(guān)于此圖例中顏色的說明，讀者請參閱本文的web版本）。